Atliktame tyrime TRPM8 antagonistas kanabigerolis, nepsichotropinis kanabinoidas, sustabdė storosios žarnos vėžio vystymąsi

 

Santrumpa

Kanabigerolis (CBG) yra saugus nepsichotropinis iš kanapės augalo išgautas kanabinoidas (CB), kuris sąveikauja su tam tikrais taikiniais, susijusiais su vėžio vystymusi. Konkrečiai, CBG galimai blokuoja neselektyvius joninius kanalus (TRP) M8 (TRPM8), aktyvuoja TRPA1, TRPV1 ir TRPV2 kanalus, blokuoja 5-hidroksitriptamino receptorių 1A (5-HT1A) ir stabdo endokanabinoidų rezorbciją. Šiame tyrime aiškinamasi, ar CBG apsaugo nuo storosios žarnos vėžio vystymosi. Nustatyta, kad CBG paskatino apoptozę, stimuliavo ROS gamybą, padidino CHOP mRNA ir sumažino CRC (storosios žarnos vėžio) ląstelių augimą. CBG poveikis ląstelių augimui buvo nepriklausomas nuo TRPA1, TRPV1 ir TRPV2 kanalų aktyvavimo, buvo dar padidintas CB2 receptoriaus antagonistu ir atkartotas kitais TRPM8 kanalų blokuotojais, bet ne 5-HT1A antagonistu. Be to, pastebėta, kad CBG poveikis ląstelių augimui ir CHOP mRNA raiškai buvo mažesnis ląstelėse, kuriose TRPM8 yra užblokuotas (angl.silenced). In vivo CBG nuslopino ksenograftų tumorų augimą, o taip pat cheminiu būdu sukeltą storosios žarnos vėžio vystymąsi. CBG sustabdė storosios žarnos vėžio progresavimą in vivo ir selektyviai nuslopino CRC ląstelių augimą- tokį poveikį turi ir kiti TRPM8 antagoistai. CBG turėtų būti svarstomas kaip CRC prevencijos ir gydymo priemonė.

Tyrimai ir rezultatai

Susirgimų vėžiu vis daugėja, o storosios žarnos vėžys pasaulyje pagal dažnumą iš visų vėžio rūšių yra trečioje vietoje tarp vyrų ir antroje vietoje tarp moterų. Todėl neatidėliotinai reikalingos naujos gydymo ir chemoprevencinės priemonės. Kanapės augalas turi virš 100 fitokanabinoidų ir kai kurie iš jų yra kandidatai būti nauja nuo vėžio gelbstinčia medžiaga. Be tiesioginio priešvėžinio veikimo, fitokanabinoidai geba sumažinti keletą svarbių šalutinių chemoterapijos poveikių.

Žinoma, kad delta9- tetrahidrokanabinolis (THC), taip pat kaip sintetiniai ir endogeniniai CB receptorių agonistai veikia signalų perdavimo kelius, susijusius su vėžio vystymusi. Tačiau klinikinis THC panaudojimas yra ribotas dėl nepageidaujamo psichotropinio poveikio. Todėl susidomėjimas nepsichotropiniais fitokanabinoidais, kurie turi mažą afinitetą CB receptoriams paskutiniu metu stipriai auga. Vienas iš labiausiai ištirtų kanabinoidų yra kanabidiolis (CBD), kuris, kaip jau pastebėta, turi priešvėžinių savybių. Kiti kanabinoidai yra mažiau ištirti. Vienas iš tokių komponentų yra kanabigerolis (CBG). Ir senesni, ir nauji tyrimai patvirtina analgetinį, priešeriteminį, antibakterinį, antidepresinį, antihipertenzinį CBG poveikį. Yra patvirtintas CBG didelių dozių citotoksinis poveikis žmogaus epitelioidinės karcinomos ląstelėms, CBG taip pat buvo efektyvus prieš krūties vėžį ir sustabdė keratinocitų proliferaciją. Be to, CBG nuslopino eksperimentinį žarnyno uždegimą, kas yra svarbu dėl to, kad neoplazijos, vedančios prieš CRC, išsivystymo rizika tarp opinio kolito pacientų yra padidėjusi. Farmakodinaminiai tyrimai parodė, kad CBG sąveikauja su receptoriais/fermentais, susijusiais su vėžio vystymusi. Konkrečiai, CBG yra silpnas dalinis CB1 ir CB2 receptorių agonistas, slopina endokanabinoidų rezorbciją, yra stiprus 5-HT1A antagonistas ir gali veikti neselektyvius jonų kanalus (TRP). Iš jonų kanalų, CBG yra TRPA1, TRPV1 ir TRPV2 agonistas ir, svarbu, stiprus TRPM8 antagonistas, o TRP kanalai žinomi kaip susiję su vėžinių ląstelių augimu. Šiame tyrime nagrinėtas CBG efektyvumas ir veikimo būdas storosios žarnos vėžio ląstelių augimui, įvertintas galimas chemoprevencinis poveikis storosios žarnos vėžio azoksimetano (AOM) modelyje ir galimas gydomasis efektas storosios žarnos vėžio ksenograftų modelyje.

Šiame tyrime nustatyta, kad CBG sumažino dviejų karcinomos ląstelių kultūrų gyvybingumą, t.y. Caco-2 ir HCT 116 ląstelėse. Kodėl CBG poveikis HTC 116 ląstelėms yra didesnis, palyginus su Caco-2 ląstelėmis kol kas neaišku ir tai negali būti dėl skirtingos TRPM8 raiškos šiose ląstelių kultūrose. Be to, pastebėta, kad CBG stipriau ir efektyviau veikė tada, kai buvo žema serumo koncentracija (1 proc. koncentracija, kuri neveikia, per se, ląstelės gyvybingumo), galimai dėl to, kad serumo proteinai toje terpėje neutralizuoja slopinantį fitokanabinoidų poveikį ląstelių gyvybingumui. Šis pastebėjimas atitinka ankstesnio tyrimo išvadas apie kanabinoidų poveikį gliomos ir prostatos ląstelėms. Be to, atmetama prielaida, kad didesnis CBG citotoksinis poveikis, esant žemai serumo koncentracijai yra dėl padidėjusio ląstelių jautrumo, nes citotoksinio DMSO (dimetilsulfoksidas) poveikis nebuvo keičiamas esant žemai (1 proc.) ar aukštai (10 proc.) FBS (angl. foetal bovine serum)  koncentracijai. Svarbu tai, kad CBG selektyviai veikė storosios žarnos vėžio ląsteles, sveikas žmogaus žarnų epitelio ląstelių kultūras veikdamas labai nežymiai.

Kadangi CBG yra TRPM8 antagonistas, pirmiausiai buvo patikrinta galima šių kanalų įtaka tiriamam CBG veikimui. TRPM8 įtakoja ląstelių proliferaciją/apoptozę ir dabar jis laikomas kovos su vėžiu taikiniu, ypatingai prostatos vėžiu. TRPM8 mRNA aptinkama daugybėje pirminių tumorų, įskaitant CRC audinius. Šiame tyrime pirmą kartą pastebėta, kad TRPM8 mRNA ir baltymų raiška CRC ląstelėse didesnė yra Caco-2, nei HTC 116 ląstelėse. Dar svarbiau, kad CBG poveikis ląstelių gyvybingumui atkartotas sintetiniu TRPM8 antagonistu AMTB, fitokanabinoidais CBD ir CBDV, kurie, kaip ir CBG geba blokuoti TRPM8. CBG buvo toks pat efektyvus, kaip ir CBD, o abu fitokanabinoidai buvo efektyvesni už CBDV ir AMTB. Skirtingai, CBC, fitokanabinoidas, kuris neblokuoja TRPM8, turėjo nedidelį poveikį storosios žarnos ląstelių gyvybingumui. Be to, TRPM8 mRNA užblokavimas lėmė sumažintą citotoksinį CBG poveikį Caco-2 ląstelėse. Apibendrinus, šie rezultatai rodo, kad TRPM8 galimai yra susijęs su CBG sukeliamu CRC ląstelių augimo slopinimu. Galiausiai, tyrime nustatyta, kad CBG turi labai nedidelį citotoksinį poveikį sveikoms žmogaus žarnų epitelio ląstelių kultūroms.

Toliau nagrinėjant šį CBG veikimo pobūdį, aptarti kiti receptoriai (CB receptoriai, TRPA1, TRPV1 ir TRPV2 kanalai, 5-HT1A receptoriai), kurie, remiantis farmakodinaminiais tyrimais yra veikiami CBG. Yra žinoma, kad CB1 ir CB2 receptorių aktyvavimas slopina storosios žarnos vėžio ląstelių augimą. CBG veikia kaip silpnas dalinis CB1 ir CB2 receptorių agonistas. Be to, CBG mažina endokanabinoidų skaidymą, kas buvo pastebėta Caco-2 ląstelėse ir todėl netiesiogiai, per padidėjusį ekstraląstelinį endokanabinoidų lygį aktyvuoja CB receptorius. Nustatyta, kad CBG poveikis ląstelių gyvybingumui nepakito dėl selektyvaus CB1 receptoriaus antagonisto AM251 įtakos ir vėliau padidėjo veikiant CB2 receptoriaus antagonistui AM630. Šie rezultatai paneigia galimybę, kad CBG tiesiogiai ir netiesiogiai veikia per CB receptorių aktyvavimą, kaip tik tikėtina, kad esantis endogeninis CB2 tonas trukdo CBG signalų perdavimui, įtakojančiam ląstelių gyvybingumo mažėjimą. Tokie pat rezultatai pastebėti peritoniniuose makrofagose, kur CBG slopinantis poveikis LPS sukeltai nitrito gamybai buvo vėliau padidintas SR144528, kitu CB2 receptoriaus antagonistu.

Pastebėta, kad CBG veikia kaip santykinai stiprus ir labai efektyvus TRPA1 agonistas ir silpnas TRPV1 ir TRPV2 kanalų agonistas. Tačiau nepanašu, kad CBG veiktų aktyvuojant TRPA1, TRPV1 ir/ar TRPV2 kanalus, nes rutenis raudonasis, neselektyvus TRP kanalų antagonistas, koncentracijomis, kurios buvo keletą kartų didesnės nei IC50, prie kurių blokuojami TRPA1, TRPV1 ir TRPV2 kanalai,  nepakeitė CBG poveikio ląstelių gyvybingumui. Taip pat tai nepanašu, kad CBG poveikis pasireiškia dėl 5-HT1A blokavimo, receptoriaus, susijusio su vėžio vystymusi, nes CBG poveikis nebuvo atkartotas gerai žinomu selektyviu 5-HT1A antagonistu.

Apoptozė ir nekrozė- tai du pagrindiniai procesai, lemiantys ląstelės mirtį. Mokslininkai jau yra nustatę, kad endogeniniai ir iš augalų išgauti kanabinoidai gali sukelti vėžinių ląstelių apoptozę. Tačiau apie CBG informacijos nėra. Naudojant eosino-hematoksicilino dažymo metodą, mokslininkai parodė, kad CBG slopinantis poveikis ląstelių augimui greičiau buvo dėl apoptozės sukėlimo, o ne nekrozės. Pro-apotozinis CBG veikimas buvo patvirtintas pastebėjus padidėjusį 3/7 kaspazės aktyvumą (dvi cisteino proteazės, konkrečiai įtrauktos į apoptozę), DNA skilimą į fragmentus ir CHOP (apoptozę aktyvuojantis baltymas) mRNA raiškos padidėjimą. CBG poveikis CHOP mRNA raiškai buvo anuliuotas Caco-2 ląstelėse, kur TRPM8 RNA yra užblokuota /nutildyta, kas sako apie CBG apoptozinį veikimą per šį kanalą.

ROS yra labai reaktyvios molekulės, paprastai liekančios po normalaus deguonies metabolizmo, kas pirmiausia gaminama mitochondrijose. Taip pat, bazinis ROS lygis, manoma, yra fiziologinis ląstelių proliferacijos ir diferenciacijos reguliatorius, esant balansui su biocheminiais antioksidantais,o didelis ROS kiekis sukelia su mitochondrijomis susijusius procesus, lemiančius apoptozę. Ryšys tarp ROS ir vėžio taip pat nustatytas pastebėjus, kad dauguma chemoprevenciškai veikiančių medžiagų gali būti selektyviai toksiškos vėžio ląstelėms, nes jos padidina oksidacinį stresą ir ROS gamybą, kas atitinkamai nulemia vėžio ląstelių apoptozę. Šioje studijoje mokslininkai parodė, kad CBG koncentracija, gebančia iššaukti apoptozę (žr. aukščiau), selektyviai padidino ROS CRC ląstelėse, o ne sveikose storojo žarnyno ląstelėse, kas leidžia manyti, kad padidinta ROS gamyba gali būti susijusi su CBG sukeliama apoptoze. Kadangi TRPM8 buvo aptikti ant ER (endoplazminio tinklo) ertmės ir ER stresas sukelia ROS ir apoptozę sukeliančio baltymo CHOP gamybą, kurią padidina CBG (pagal gautus rezultatus), keliama hipotezė, kad ER gali būti vienas iš ROS šaltinių.

Pasitvirtinus CBG poveikiui CRC ląstelėse, buvo įvertintas antivėžinis veikimas ir ikiklinikiniame in vivo storosios žarnos vėžio vystymosi modelyje. Pastebėta, kad kasdieninė 3 ir 10 mg/kg injekcija pelėms sumažino įvestų CRC ląstelių ksenograftų augimą. Nors ksenograftų modeliai jau seniai naudojami naujų vaistų bandymuose, tačiau ksenograftų tumorai nesivysto in situ, todėl juose trūksta ląstelių sąveikos su svetimkūnio aplinka. Todėl CBG antivėžinis veikimas buvo išbandytas AOM (azoksimetano) storosios žarnos vėžio vystymosi modelyje, kuriame vėžys vystose žarnos audinyje. Anksčiau, eksperimentiniame storosios žarnos vėžio modelyje mokslininkai pastebėjo, kad farmakologinis endokanabinoidų lygio padidinimas sumažino ikivėžinius pakitimus ir kad kitas kanabinoidas, CBD, pasireiškia chemoprevenciniu poveikiu. Nustatyta, kad skiriama CBG 5 mg/kg dozė visiškai panaikino ACF formavimąsi, neturėjo poveikio polipų formavimuisi ir per pusę sumažino tumorų, sukeltų AOM pelėse. Tokiomis pačiomis dozėmis CBD žymiai sumažino ikivėžinius pakitimus, polipus ir tumorus, o poveikis nepriklausė nuo naudojamų dozių. Neseniai pastebėta, kad 5 mg/kg CBG dozė sumažino kolitą eksperimentiniame pelių modelyje, kas yra svarbu, turint omenyje gerai žinomą žarnyno uždegimo ir storosios žarnos vėžio sąsają.

Išvados

Pagal gautus tyrimų rezultatus, daroma išvada, kad nepsichotropinis Cannabis ingredientas CBG slopina CRC ląstelių vystymąsi, didžiausia dalimi per pro-apoptozinį mechanizmą ir stabdo storosios žarnos vėžio formavimąsi ir augimą in vivo. Slopinantis CBG poveikis tumoro ląstelių augimui siejamas su padidinta ROS gamyba ir yra atkartotas kitu TRPM8 antagonistu, kas leidžia spėti, kad šis receptorius yra, bent jau dalinai susijęs su jo veikimu. Turint omenyje iš kanapės išgautų kanabinoidų saugumą, mokslininkai tikisi radę CBG, kaip daug žadančią veikliąją medžiaga prieš CRC– ir gydančią, ir prevencinę.